腦(nǎo)脊液中腦(nǎo)膜癌細胞CEA表達的(de)研究

【摘要(yào)】目的(de):聯合應用(yòng)免疫熒光(guāng)細胞化(huà)∞∑∞學技(jì)術(shù)和(hé)激光(g↔≥π★uāng)掃描共聚焦顯微(wēi)鏡技(jì)術(shù)γ¶α(LSCM)檢測腦(nǎo)脊液中腦(nǎo)膜癌細胞CEA的(de)表達部位并定量測定其₹​₽熒光(guāng)含量，探討(tǎo)該技(jì)術(shù)在腦(nǎo)膜癌病診δ>§&斷中的(de)價值。 方法:應用(yòng)免疫熒光(guāng)細胞化(huà≤☆α¶)學法以CEA标記腦(nǎo)膜癌細胞及對(duì)照(zhào)組腦(nǎo)☆ ≈≈脊液細胞，采用(yòng)LSCM技(jì)術 ​(shù)獲得(de)腦(nǎo)膜癌細胞掃描圖像并定量測定CEA熒光(guā↑±ng)強度值。結果:腦(nǎo)脊液中腦(n₹ ‍ǎo)膜癌細胞的(de)CEA表達為(wèi)陽性，且部位在細胞漿中;CEA平均熒光(guāng§λ↑λ)值(36.80±17.17)，與對(duì)照(zhà<‍πo)組(4.87±1.86 ¶φφ)相(xiàng)比差異有(yǒu)統計(jì)學意義£<​(P<0.01)。結論:聯合應用(yòng≈¥)免疫熒光(guāng)細胞化(huà)學法和(hé)LSCM檢測腦(nǎo)脊液α♠™細胞中CEA的(de)表達可(kě)為(wèi)腦(nǎo)膜癌病的↓δ(de)診斷提供可(kě)靠依據。

【關鍵詞】腦(nǎo)膜癌病;腦(nǎo)脊液;CEA;激光(guāng‍×)掃描共聚焦顯微(wēi)鏡;免疫熒光(guāng)

本研究聯合應用(yòng)免疫熒光(guānΩ×g)細胞化(huà)學技(jì)術(shù)和(hé)φ≠∏ 激光(guāng)掃描共聚焦顯微(wēi)技(jì)術(sΩ​↕αhù)對(duì)20例腦(nǎo)膜癌病(meningealcarcinomatosis,MC)‌©患者的(de)腦(nǎo)脊液細胞進行(xín©¶$αg)綠(lǜ)色熒光(guāng)平均值(CEA)檢測σ‍β，以探討(tǎo)該方法在MC診斷中的(de)價值。

1、材料與方法

1.1 标本來(lái)源：20例MC患者為(wèi)2007年(nián)8月(yuè)至2008年(nián)8月(y‍βuè)本院、南(nán)京腦(nǎo)科(kē)醫(y✔♠®ī)院門(mén)診及住院收治。男(nán)9例，女(nǚ)11例，平均年(niá∞×₩'n)齡51歲。按腫瘤來(lái)源：肺腺癌10例、乳腺癌2例、絨毛膜癌1例、子σ♦£(zǐ)宮內(nèi)膜癌1例、惡性髓母細胞瘤2例、未找到(dào)原發病竈4例。16例轉&α™移癌病例均由組織病理(lǐ)證實。對(duì)照(zhào)組20例均為₩↓$(wèi)同期本院神經內(nèi)科(kē)住院收治，經腦(nǎo)脊☆÷$液細胞學診斷為(wèi)病毒性腦(nǎo)膜炎且随訪已治愈。男(nán "α)8例，女(nǚ)12例，平均年(nián)齡41歲←₹。

1.2 試劑與儀器(qì)：兔抗人(rén)CEA、FITC-羊抗兔IgG均購(₹ α★gòu)自(zì)北(běi)京博奧森(sēn)生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)≤∑¶公司;Cytospin-3型細胞玻片離(lí)心儀，英國(guó)Shan↔"≠don公司生(shēng)産;TCS-SP5型激光(gu ×↑♥āng)共聚焦掃描顯微(wēi)鏡，德國(g €εuó)Leica公司生(shēng)産，第三軍醫(yī)↕ε大(dà)學提供使用(yòng)。

1.3 方法

1.3.1 CEA标記：設肺腺癌胸水(shuǐ)陽性對(duì)照(zhào)組&×←←、PBS自(zì)發熒光(guāng)對(duì)照(zhào)♣δ組、PBS+二抗熒光(guāng)标記物(wù)對(duì)↓₹↓γ照(zhào)組。标本玻片以10%羊血清封閉30min，滴加1∶100兔抗人(rén)CEA•✘™​，置濕盒內(nèi)37℃孵育1h,4℃過夜，再加入1∶20FITC-羊抗兔IgG,避♥£§↔光(guāng)置濕盒內(nèi)37℃孵育1h，滴加1∶1000Dλ≥  API室溫10min，甘油封片，以上(shàng)每步驟間(÷φ jiān)均以0.01MPBS漂洗3遍。

1.3.2 激光(guāng)掃描共聚焦顯<€微(wēi)鏡觀察：分(fēn)别用(yòng)488nm和(hé)405nm波₹↑₽π長(cháng)的(de)激光(guāng)器(qì)激發綠(lǜ)色和(hé)藍(lán)色熒光÷ >(guāng)。CEA相(xiàng)對(duì)熒光(guāng)含量檢測結果以平均熒光(g≠ uāng)值和(hé)熒光(guāng)強度地(dì)形立體(tǐσ™♣σ)分(fēn)布圖表示。實驗組及對(duì)照(zhào)組各随機(jī)&‍‍選取200個(gè)高(gāo)倍鏡視(s∑φπhì)野的(de)細胞，測定每個(gè)細胞內(nèi↑∏↔)CEA含量的(de)相(xiàng)對(duì)熒光(guāng)值及細胞面積、周'<長(cháng)。

1.4 統計(jì)學方法：本實驗采用(yòng)SPSS11.5統計(jì)軟件(jiàn)，組間(jiān)€×比較采用(yòng)t檢驗，P<0.05為(wèi♣§$)差異有(yǒu)統計(jì)學意義。

2、結果

2.1 LSCM掃描熒光(guāng)圖像及CEA的(de)表λ‍₹達部位：腦(nǎo)膜癌細胞的(de)胞漿內(nèi)可₩✔↑±(kě)見(jiàn)分(fēn)布均勻的(de)綠(lǜ)色熒光(guāng)，CE∞✘∑A表達于胞漿;其餘淋巴、單核細胞等僅見(jiàn)DAPI染色的(de)藍(lán㩧β)色細胞核，胞漿未著(zhe)色。對(duì)照(zhào)組腦(nǎo)脊液細胞僅見(↕φ&jiàn)藍(lán)色的(de)細胞核，胞膜、胞漿及胞核內(nèi)未見(ji±≤‍àn)綠(lǜ)色熒光(guāng)，提示無CEA表達

2.2 CEA熒光(guāng)強度地(dìπ₩)形立體(tǐ)分(fēn)布圖：腦(nǎo)膜癌細胞圖像為(wèi)不(bù)規則的(de)蛋糕形，中心凹陷呈火‍₽ §(huǒ)山(shān)口狀，底部可(kě)見(jiàn)藍(lán)色細♦β÷胞核區(qū)域;胞漿區(qū)域呈環形，頂端不(bù)平坦，←επ黃(huáng)、紅(hóng)色山(shān)峰呈♣✔↕鋸齒樣突起，相(xiàng)對(duì)熒光(guāng)含量由低(d"εī)到(dào)高(gāo)(0→255)藍(lán)§×→綠(lǜ)→黃(huáng)→'¶紅(hóng)。對(duì)照(zhào)組腦(nǎo)脊液πσ細胞地(dì)形平坦，僅見(jiàn)藍(lán)色腎形細胞核區(qū)域，胞漿基本↕φ¶無熒光(guāng)分(fēn)布，單核細胞。

2.3 腦(nǎo)膜癌細胞與對(duì)照(zhào) &組腦(nǎo)脊液細胞CEA熒光(guāng)相(xiàng)對(duì)含量及形态學參數(s≥Ω↑hù)比較：腦(nǎo)膜癌細胞與對(duì)照(zhào)組腦(nǎo)脊液細胞§π ↑CEA熒光(guāng)含量相(xiàng)比差異有(yǒu)統計(jì)學意義(P&₽'lt;0.01)，腦(nǎo)膜癌細胞的(de)面積、周長(cháng)與對₹ '(duì)照(zhào)組腦(nǎo)脊液細胞相(xiàng)比差異有(♦≠§​yǒu)統計(jì)學意義(P<0↔φφ.01)。

兩組腦(nǎo)脊液細胞EMA/CEA熒光(guāng)相(xi↓☆àng)對(duì)含量及形态學參數(shù)的(de)比較

3、討(tǎo)論

MC是(shì)由于惡性腫瘤在蛛網膜下(xià)腔和(↓★♦hé)軟膜內(nèi)彌漫性轉移而引起的(de)一(yī)系列臨床綜合征，α↓在癌症患者中發生(shēng)率為(wèi)5%-8%，目前有( φyǒu)上(shàng)升趨勢[1]。肺癌、乳腺癌、胃腸道(dào)癌是(shì)腦(nǎ♠£o)膜癌最常見(jiàn)的(de)原發竈，腺癌是(shì)其主要(yà₹≈∏o)組織類型[2]。腦(nǎo)膜癌病臨床表現(xiàn)複雜(zá)÷♥，在腦(nǎo)脊液中找到(dào)腦(nǎo)膜癌細胞是(s₹Ωhì)診斷本病的(de)最終标準[3]。據報(bào)道(dào)[4]MC患者首次腰'π穿發現(xiàn)腫瘤細胞的(de)陽性率僅為(₽↓♥wèi)45%-60%。

劉振華等[5]報(bào)道(dào)常規CSF細胞學發現(x→←×iàn)腫瘤細胞的(de)陽性率為(wèi)41.86%，應用(y♦≥≠πòng)CEA免疫細胞化(huà)學法可(k짧↔)将陽性率提高(gāo)到(dào)83.72±< %。Liu等[6]報(bào)道(dàoπ↓)CEA等上(shàng)皮來(lái)源的(de)标記物(wù)在腦(nǎo)膜癌組的(de)>↕陽性例數(shù)為(wèi)80%，在良惡性腦(nǎo)膜瘤組β∑™為(wèi)0%，提示多(duō)抗體(♣✘tǐ)免疫組化(huà)檢測可(kě)鑒别腫瘤細胞的(de)組織來(lái)源。本♥₹實驗MC組CEA陽性率為(wèi)90%(18/20);常規MGG染色陽>↓γ♠性率60%(12/20)，兩者相(xiàng)比差異有(yǒu)統計(jì)學÷★ 意義(P<0.05)，提示免疫細胞化(huà)學染色可(kě)顯著提高(gāo)腦(nǎo£©)膜癌病的(de)診斷率，與國(guó)內(nèi)外(wài)研究一(yī)緻。Mar≈‍♣$tínez等[7]應用(yòng©∞​™)免疫熒光(guāng)雙标和(hé)LSC λ₩"M技(jì)術(shù)對(duì)腦(nǎo)膜血管外(wài)皮細胞瘤中的(de)抑±ε♦癌基因進行(xíng)了(le)研究。嶽劍甯等[8₹ ]用(yòng)LSCM對(duì)腦(nǎo)脊液淋巴白(bái)血病細胞線粒體(tǐ)進行(≈→♠xíng)了(le)立體(tǐ)、定量研究。LSCM觀察可(kě)見(jiàn§♠ δ)細胞核與DAPI結合呈明(míng)亮±♠(liàng)的(de)藍(lán)色熒光(guāng)，未見(jiàn)綠(lǜ)色熒光(gu÷σāng)，提示胞核內(nèi)無CEA表達;胞漿內(nèi)可(kě)見( ®π✘jiàn)分(fēn)布均勻的(de)明(míng)亮(li↔>♥‌àng)的(de)綠(lǜ)色熒光(guā®•¥ng)，提示CEA表達于胞漿，與國(guó)內(nèi)外(wài)報(b€≠®∞ào)道(dào)一(yī)緻[9]。從(cóng)熒光(↓>γguāng)強度地(dì)形立體(tǐ)σ✘β分(fēn)布圖可(kě)見(jiàn)腦(nǎo)膜癌細胞胞₽γ≈↕核CEA含量極少(shǎo)，而胞漿內(nèi)CEA含量較高(gāo)，亦與上(sγ‌©hàng)述分(fēn)布相(xiàng)符。對(duì)照(zhào)組細胞面積和(hé)周長(↕×♥​cháng)相(xiàng)對(duì)較小(xiǎo)，胞漿內(nèi)•§€CEA含量極低(dī);而腦(nǎo)膜癌細胞面積和(hé)周長(c☆≥háng)相(xiàng)對(duì)較大(dà→✘• )，胞漿內(nèi)CEA含量較高(gāo)↔ε↕，兩組之間(jiān)相(xiàng)比差異有(yǒu)統計(jì✘ δδ)學意義(P<0.01)。本實驗MC組中2例髓母細胞瘤檢測CEA陰性，與文(wén€↕♣)獻報(bào)道(dào)一(yī)緻[10]。

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