非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝(xiè)組學的(de)初步研究

【摘要(yào)】目的(de):初步研究非綜合征性唇腭裂患者可(kě)能(néng)☆≈存在的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zhì↓¶)，同時(shí)探討(tǎo)基于核磁共振(NMR)的(de)代謝€β (xiè)組學技(jì)術(shù)在臨床應用(yòng)中的(de)可(kě) ₩✘行(xíng)性。方法:分(fēn)别收集10例非綜合征性唇腭裂患者和(hé)1β₩0例正常人(rén)的(de)血漿，在核磁€₽共振儀上(shàng)對(duì)血漿樣本進行(xíng)采樣，獲得(de)一(yī)系列原∑♥♣φ始的(de)一(yī)維NMR譜圖，然後使用(yòng) ​₹MESTRE-v4.7軟件(jiàn)對Ω∞(duì)NMR譜圖進行(xíng)積分(fēn)簡化(huà)數(shù)據，将譜圖分(f'♥¶ēn)解成212個(gè)區(qū)域進行(xíng)積分(fēn)，得(de)到(dào)積 ♥★≈分(fēn)強度，利用(yòng)SIMCA-P11.0軟件(λ'®jiàn)對(duì)積分(fēn)強度進行(xíng)主成分(fēn)分(fβ ēn)析。結果:非綜合征性唇腭裂患者和(hé)正常人(rén)的(de)血漿代謝(xiè)存≥₩≠在差異，至少(shǎo)存在3種不(bù)同的(de)代謝(xi×₹φè)産物(wù)，分(fēn)别為(wèi)三羟丁酸&gammσ←σπa;甲基類物(wù)質、精氨酸和(hé)缬氨酸。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝(xiè)産物(wù)¶≤以缬氨酸和(hé)三羟丁酸γ甲←"×基類物(wù)質為(wèi)主，而正常人(rén)血漿代謝(xiè嶶β)産物(wù)則以精氨酸為(wèi)主。結論:通(tōng)過代謝(xiè)組學技(jì↓↕$)術(shù)，可(kě)以初步探討(tǎ≈δ​₩o)非綜合征性唇腭裂患者的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zhì)，同時(shí)該技≥π(jì)術(shù)有(yǒu)望應用(yòng)于臨床。

【關鍵詞】代謝(xiè)組學;非綜合征性唇腭裂;主成分(fēn)分(fēn)析

非綜合征性唇腭裂是(shì)口腔颌面部最常見(jiàn)的(de)先天性發育畸形，占整個(gè)颌®₹面部面裂畸形的(de)70%以上(shà§$ng)。該病發病因素複雜(zá)，對(duì)其病因學的(de)研究意義重大(dà)。若能(nén♣<∞g)明(míng)确其發病原因，并采取有(yǒu)效的(de)幹預措施，有(yǒu)望從( ™cóng)根本上(shàng)預防該疾病的(de)發生(shēng)。目¶☆前，對(duì)唇腭裂的(de)病因學研究取得(de)了(le)一(€λ₽​yī)定的(de)進展，如(rú)發現(xiàn)唇腭裂是(shì)多(duō≠≥↑★)因素遺傳疾病，與孕期吸煙(yān)、用(★>€πyòng)藥等因素有(yǒu)關等^①③，但(dàn)其确切的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zh∑β÷ì)和(hé)發病原因尚不(bù)清楚。本文(wé®→♦n)通(tōng)過研究非綜合征性唇腭裂患者血漿的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zhì)，推₹★≠斷其潛在的(de)發病原因，同時(shí)探討(tǎo)基于核磁共振←←♣≈(nu-clearmagneticresonance，NMR)的(de)代謝♣$®(xiè)組學在臨床應用(yòng)中的(de)可(kě)行(xíng₹•)性。

1、材料和(hé)方法

1.1 試驗儀器(qì)

本試驗使用(yòng)的(de)主要(yào)儀器(qì)有(yǒu)：Bru¶•→kerAvanceDRX600核磁共振儀(Bruker公司✔≥，德國(guó));XYJ80-2低(dī)∞"≤速離(lí)心機(jī)(江蘇金(jīn)壇實₽​驗儀器(qì)有(yǒu)限公司);MR1812高(gāo)速離(lí)心機(jī‌&)(Jouan公司，法國(guó));4mL肝素鈉抗凝管(BectonDickins→₩¥↕on公司，美(měi)國(guó));FD-1冷(lěng×  ∏)凍幹燥機(jī)(北(běi)京博康實驗儀器(qì)有(yǒu)限公司)。

1.2 研究對(duì)象的(de)選擇

随機(jī)選擇2004—2005年(nián•‌)在四川大(dà)學華西(xī)口腔醫(yī)院唇腭裂外(wà♣≥i)科(kē)行(xíng)手術(shù​←₹)治療的(de)非綜合征性唇腭裂患者10例作(zuò)為(wèi)病例組，其中單純性☆'≥α腭裂患者6例，唇裂并發腭裂患者4例;女(nǚ)性8例，男(nán)性2例;年($∑ ♣nián)齡6～19歲，平均年(nián)齡(12.6±λ↑‌6.5)歲。同時(shí)随機(jī)選擇2004&mdaπε&sh;2005年(nián)在四川大(dà)±σ學華西(xī)醫(yī)學中心婦幼保健院查體(tǐ) φ的(de)健康人(rén)10例作(zuò)為(wèδ‌i)對(duì)照(zhào)組，女(nǚ)性8例，男(nán)性2例;年≤®α✘(nián)齡7～20歲，平均年(nián)&δ♣齡(13.0±5.1)歲。病例組納入标準：診≥•✘α斷為(wèi)非綜合征性唇腭裂的(de)患者λ→γ✔，無其他(tā)系統性疾病。排除标準：1)患有(yǒu)綜合征性唇腭裂如(rú)Shpriα≈←ntzen綜合征或Robbin綜合征者;2)患有(yǒu)先天性代謝(x€' iè)缺陷

如(rú)楓糖尿症患者;3)臨床生(shēng)化(huà)結果異常者，或者患有(yǒu)血液系™ 統疾病者;4)傳染病患者如(rú)獲得(de)性免疫缺陷綜合征、B或C型肝炎β ♦等^④⑤。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集及處理(lǐ) 樣本采集前，2組研究對(duì)象要(yào)求空(kōng)腹6h。樣本采集于上(shàn§§¥g)午9時(shí)左右在室溫下(xià)進行(xíng)。抽取研究對(duì)象靜(jìng)Ω✘↕÷脈血液4mL，緩慢(màn)注入4mL肝素鈉抗凝管中，室溫下(xià)1500r/min低(dī)≠&∞速離(lí)心10min，以去(qù)除全血中血細胞等大(dà)®→∏§分(fēn)子(zǐ)物(wù)質。離(lí)心後用(yòng)移液槍吸取上(shà× 'ng)清液(即血漿)2mL放(fàng)入EP管內(nèi)，進≥α≥γ行(xíng)二次離(lí)心(4℃下(xià)20000r/min離(lí)心10mi $•βn)，以去(qù)除血漿中的(de)雜(zá)質，保留®™×血漿中的(de)小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)代謝(xiè)物(wù)質。離  •(lí)心後吸取上(shàng)清液1.8mL放(fàng)入幹淨​♦¥©的(de)EP管內(nèi)，将樣本進行(xíng)凍幹處理(lǐ)，然後保存在-↑α¶20℃低(dī)溫冰箱中備用(yòng)。

1.3.2 NMR數(shù)據的(de)采集 将凍幹處理(lǐ)過的(de)血漿樣本在室溫下♥♠​(xià)解凍，将450μL解凍樣本移入幹淨的(de)核磁管內(nπ  §èi)，以體(tǐ)積比1∶10的(de)比例緩慢(màn)加入重水(shuǐ)至500&m≠<u;L，混勻，靜(jìng)置5min。每個(gè)樣本制σ♦σ (zhì)備完成後直接在核磁共振儀上(shàng)進行(x×≥₹íng)光(guāng)譜采集，獲得(de)原始的(de)一(yī)維氫譜。光(gu→↕≠∑āng)譜采集在室溫下(xià)進行(xíng)，采樣點數(♦εshù)是(shì)32k，累加次數(shù)128次，核磁共振儀實₹↑≠£際工(gōng)作(zuò)頻(pín)率為(wè®™‌→i)600.13MHz。掃描對(duì)水(shuǐ)峰進行(xíng)抑制(zhφ✔ì)的(de)原始一(yī)維氫譜，可(kě)以獲♦π得(de)

131072個(gè)數(shù)據點，其峰寬度為(wèi)7788.✔σε16Hz，最小(xiǎo)頻(pín)率為(wèiδ∏≤)-1073.15Hz。掃描未進行(xíng)水(shuǐ)峰抑制(zhì)的(de φ&)氫譜同樣可(kě)獲得(de)131072個(gè)數(shù)¥✘®據點，其峰寬度為(wèi)7183.91Hz,最小(xiǎo)頻(pín)率為(wèi)-651₩©™.29Hz。

1.3.3 NMR數(shù)據後加工(gōng)過程和(h←₹‌€é)化(huà)學計(jì)量分(fēn)析方法 所有(yǒu)樣本的(de)自(zì)由感£≈σβ應衰減(freeinductiondecay，FI★≤←D)信号導入MESTRE-v4.7軟件(jiàn)進行(xíng)傅裡(×₽lǐ)葉轉換(Fouriertransform，FT)，獲得(de)一(yī)維NMR譜圖σβ®，将所獲得(de)的(de)譜圖進行(xíng)基線調整。由于δ4. &λ↕52～6.00含有(yǒu)水(shuǐ)峰^⑥⑦，該區(qū)域的(de)化(huà)學位移被排除在外(wài)。将各個(gè)樣  本的(de)氫譜δ0～4.52及δ6～1 ★0按bin0.04為(wèi)單位進行(xíng)分(fēn)割，得(de)到≥→α÷(dào)212個(gè)化(huà)學位π∞&φ移值段，進一(yī)步按各化(huà)學位移值段分(fēn)别積分(fēn)，即得(de)到(•∑dào)與各個(gè)化(huà)學位移值段相(xiàng)對(duì)應≈​的(de)積分(fēn)值，這(zhè)樣就(jiù)簡化(huà)了(le)原始數β™ (shù)據(圖1)。對(duì)每個(gè)樣本進行(xíδ$₹™ng)光(guāng)譜采集，可(kě)獲得(de)20組數(shù)據，構成1個(gè)≤ n×d二維矩陣(其中n為(wèi)樣本組數(shù)，d©₩為(wèi)積分(fēn)區(qū)間(jiān)數£  ↕(shù))，這(zhè)樣更具有(yǒu)統計(jì)學意義。将數(shù)↕♦↑↓據導入Excel文(wén)件(jiàn)中備用(y♠§‌ òng)。使用(yòng)SIMCA-P11.0軟件(jiàn)£≤‌對(duì)該二維矩陣進行(xíng)化(huà)學計(jì)量處理(₽§∏lǐ)，主要(yào)進行(xíng)主成分(fēn)分(fēn↕‌≠σ)析(principalcompo-nentanalys₹§≠is，PCA)。

2、結果

本研究中所建立的(de)新變量模型含有(yǒu)9個(gè)主成分ε↕(fēn)(principalcomponent，PC)，前2個(gè)主成分(f'$£★ēn)(PC1和(hé)PC2)的(de)累積貢獻率為α>β±(wèi)93.5%，說(shuō)明(míng)所建立的(de)變量具有(yǒu)很(hσ≥"≈ěn)好(hǎo)的(de)預測性。前2個(gè)主成分(fēn)的(de)PC圖見(jià€•n)圖2。由圖2可(kě)以看(kàn)出，對(duì)照(z₩ε§hào)組樣本間(jiān)變異較大(dà)，病例組樣本間(jiān)則具有(yǒuλ☆​≥)高(gāo)度相(xiàng)似性，但(dàn)這(zhè)2個(gè)主成分(fēn≈'​>)不(bù)能(néng)完全區(qū)分(fēn)2組的(de)樣本。第2和(hé)第3個(₽ελgè)主成分(fēn)(PC2和(hé)PC3)的(de)PC圖見(ji≤£àn)圖3，這(zhè)2個(gè)主成分(fēn)可(kě)以區(qū)分(f∞♠₹÷ēn)病例組和(hé)對(duì)照(zhào)組，因此筆(≥∑☆bǐ)者選用(yòng)PC2和(hé)PC3作(zuò)為(wèi)研究≤★☆®對(duì)象。圖4為(wèi)PC2和(hé)PC3的(de)因>'$÷子(zǐ)負荷圖，可(kě)見(jiàn)圖中大(dà)多(duō)數(shù)點集中♣✔★于原點，表現(xiàn)為(wèi)重疊點，即具有(yǒu)相♣‌ (xiàng)同的(de)代謝(xiè)産物(wù)，也(yě)就(jiù)是(shì" )說(shuō)病例組和(hé)對(duì)照(zhào)組具有(yǒu)相(xiàng)同的(d"÷§♣e)代謝(xiè)産物(wù);但(dàn)是(shì)有(yǒu)少׶☆(shǎo)數(shù)的(de)點遠(yuǎn)離(lí)原點，這(↔© ≠zhè)些(xiē)點所代表的(de)化(huà)合物(×δ÷wù)造成了(le)某些(xiē)樣本間(jiān)血漿代謝(x׶♠iè)物(wù)的(de)差異，主要(yào)表現(xiàn)為(wèi)氨¥♥±基酸及脂類物(wù)質的(de)異常代謝(xiè)。對(duì)這(zhè)些(xiē)異®∏Ω∑常代謝(xiè)物(wù)作(zuò)進一(yī)步分(fēn)析，引起這(zhè)種差異的(♣×<de)代謝(xiè)物(wù)的(de)NMR峰主要(yào)集中在δ1.₩≥☆✔20、δ1.80、δ3≈β←≠.60(圖4)。對(duì)發生(shēng)變化(huà)的(de)÷<♦NMR譜峰進行(xíng)分(fēn)析β©•≠，這(zhè)些(xiē)化(huà)學位移值分(fēn)别代表一(yī)些(∑≈xiē)氨基酸及脂類物(wù)質，如(rú)精氨酸、缬氨酸和¥&≈$(hé)三羟丁酸γ甲基類物(wù)質等^⑥⑧。對(duì)照(zhào)組血漿代謝(xiè)産物(wù)中以精氨酸為(wè→&i)主，而病例組血漿代謝(xiè)産物(wù)則含有(yǒu)三羟丁酸γ∑≠β甲基類物(wù)質和(hé)缬氨酸。

3、討(tǎo)論

先天性唇腭裂危害著(zhe)口腔颌面器(qì)官的(de)形态及功能(né₹∞ng)，嚴重影(yǐng)響了(le)出生(shēng)人(rén)口素質及母嬰身(shēn)心"γ健康。從(cóng)遺傳學上(shàng)，該疾病可(kě)分(fēn)為(wèi)綜合征性唇×γ£腭裂與非綜合征性唇腭裂，其中非綜合征性唇腭裂最為(wèi)多ε✔¶(duō)見(jiàn)。非綜合征性唇腭裂是(shì)一(yī)個(gè)複雜(z•"á)的(de)、由遺傳和(hé)環境因素相(xiàng)互作(zuò)用(yòng)所緻♦£<§的(de)疾病，其代謝(xiè)産物(wù)可(kαε₩ě)能(néng)會(huì)出現(xiàn)異常表達。本研究運用(yòng)代謝(xiè)組學對¥♣¥₩(duì)10例非綜合征性唇腭裂患者和(hé)10例正常人(rén)進行(xín∑≥<g)分(fēn)析，初步了(le)解非綜合征性唇腭裂​↓患者的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zhì)。結果發現(↕€♦§xiàn)，非綜合征性唇腭裂患者和(hé€∏∑)正常人(rén)在血漿代謝(xiè)産物(wù)上(shàng)存在差異★∞，其差異主要(yào)表現(xiàn)在某些(xiē)氨基酸的↕¥₹₩(de)異常代謝(xiè)上(shàng≤δ>↔)，如(rú)精氨酸和(hé)缬氨酸。正常人(rén)血漿代謝(xiè)産π←↕物(wù)中以精氨酸為(wèi)主，而非綜合征ε±φ性唇腭裂患者血漿代謝(xiè)産物(wù)則含有(yǒu)三羟 ♣±<丁酸γ甲基類物(wù)質和(hé)缬氨酸。精氨酸是φ₹≤<(shì)鳥氨酸循環中的(de)重要(yào)組≤♣成成分(fēn)，具有(yǒu)極其重要(yào)的(de)生(shēng)理(lǐ)功能(¥♣néng)，在嬰幼兒(ér)發育中起著(zhe)重♣≠₽要(yào)的(de)作(zuò)用(y♥✔÷òng)，若缺乏則不(bù)能(néng)維持嬰幼兒(ér)正常的(de)生(shēng)長(™∑cháng)與發育。缬氨酸為(wèi)必需氨基酸，作(zuò)用(yòn©₽♣♦g)于黃(huáng)體(tǐ)、乳腺及卵巢，其功能(néng)★↓§∑主要(yào)是(shì)維持神經系統功能(néng)正常。三©γ ®羟丁酸γ甲基類物(wù)質在血漿中表現(xiàn)為↔λφ(wèi)低(dī)密度脂蛋白(bái)，在某些(xiē)腫瘤患者血漿中表現(xiàn±≈₽)為(wèi)高(gāo)表達的(de)岩藻糖甲基脂蛋白(bái)。

本研究結果提示，運用(yòng)代謝(xiè)組學技(jì)₩★∑術(shù)可(kě)以早期篩查某種疾病并探討(tǎo)其代謝(xiè)機Ω≠‌(jī)制(zhì)，也(yě)說(shuō)明(míng)±↔‌在此基礎上(shàng)推斷其潛在的(de)發病原因是(s→φ✘§hì)可(kě)行(xíng)的(de)。但(dàn)α↓★γ本研究僅僅在技(jì)術(shù)方法上(✔≤shàng)進行(xíng)了(le)一(yī)些(xiē)探索，得φ∞(de)出了(le)部分(fēn)有(yǒu)意義的↔σ™÷(de)結果，在下(xià)一(yī)步工(gōng)作(zuò)中，筆(bǐ)者拟從(cóπ'♣ ng)兩方面進行(xíng)深入的(de)研究±↕σ：一(yī)方面嚴格控制(zhì)受試者的(de)飲食，主要(yào)是(shδ®↑ì)禁止食用(yòng)含有(yǒu)魚肉和(hé)櫻桃等食品，因為(wèi)代↔σ謝(xiè)組學容易受到(dào)飲食習(xí)慣、生(shēng)活方←λ✔式和(hé)文(wén)化(huà)差異等因素的(de)影(yǐng™©∏)響;另一(yī)方面應擴大(dà)樣本含量，使其β₽​≤更具有(yǒu)統計(jì)學意義。研究α↔→生(shēng)物(wù)體(tǐ)液最有(yǒu)效和(hé)全面的•ασ≈(de)方法是(shì)對(duì)其基因、∑'₽蛋白(bái)質表達水(shuǐ)平和(hé)代★£謝(xiè)濃度同時(shí)進行(xíng)監 ×測。如(rú)何把代謝(xiè)組學數(shù)據和(hé)轉錄組學、蛋白(b×Ωái)質組學、遺傳學、酶學、代謝(xiè)途徑和(hé)表現(xiàn♠®)型分(fēn)析的(de)數(shù)據整合在一(yī)起，并給出生↑>∞(shēng)物(wù)學功能(néng)的(de)解釋是(shì)很(hěn)艱巨的(de)任務<↑。它們的(de)整合除了(le)需要(yào)适當的(de)數(>&shù)據庫外(wài)，還(hái)需要(yào)多(duō)種先進≤≤ε↓的(de)數(shù)學分(fēn)析方法。随著(zhe)基因組✘₹♥學、蛋白(bái)質組學和(hé)代謝(xiè)組學認識的(de)<→不(bù)斷深入和(hé)研究工(gōng)↕↔作(zuò)的(de)不(bù)斷積累，這(zhè)些(xiē)技(jì)術(shù)必将會∑Ω☆(huì)越來(lái)越廣泛地(dì)§'✔β應用(yòng)于生(shēng)物(wù)醫(yī)學研究之中。

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